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生物安全柜技术分析

生物安全柜技术分析
 
 
摘要:生物安全柜(Biological safety cabinets,BSCs)是为操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等具有感染性的实验材料时,用来保护操作者本人、实验室环境以及实验材料,使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的。
关键词:生物安全柜 技术分析


 生物安全柜(Biological safety cabinets,BSCs)是为操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等具有感染性的实验材料时,用来保护操作者本人、实验室环境以及实验材料,使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的。当操作液体或半流体,例如摇动、倾注、搅拌,或将液体滴加到固体表面上或另一种液体中时,均有可能产生气溶胶。在对琼脂板划线接种、用吸管接种细胞培养瓶、采用多道加样器将感染性试剂的混悬液转移到微量培养板中、对感染性物质进行匀浆及涡旋振荡、对感染性液体进行离心以及进行动物操作时,这些实验室操作都可能产生感染性气溶胶。由于肉眼无法看到直径小于5μm 的气溶胶以及直径为5~100μm 的微小液滴,因此实验室工作人员通常意识不到有这样大小的颗粒在生成,并可能吸入或交*污染工作台面的其他材料。已经表明,正确使用生物安全柜可以有效减少由于气溶胶暴露所造成的实验室感染以及培养物交*污染。生物安全柜同时也能保护环境。
  多年以来,生物安全柜的基本设计已经历了多次改进。主要的变化是在排风系统增加了HEPA 过滤器。对于直径0.3μm 的颗粒,HEPA 过滤器可以截留99.97%,而对于更大或更小的颗粒则可以截留99.99%。HEPA 过滤器的这种特性使得它能够有效地截留所有已知传染因子,并确保从安全柜中排出的是完全不含微生物的空气。生物安全柜设计中的第二个改进是将经HEPA 过滤的空气输送到工作台面上,从而保护工作台面上的物品不受污染。这一特点通常被称为实验对象保护(product protection )。这些基本设计上的变化使得三种级别的生物安全柜都得到了改进,表8 列出了各种安全柜所能提供的保护。
  注:水平和垂直方向流出气流的工作柜( “超净工作台”)不属于生物安全柜,也不能应用于生物安全操作。
  ○不同保护类型及生物安全柜的选择
保护类型 生物安全柜的选择
个体防护,针对危险度1~3 级微生物 Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级生物安全柜
个体防护,针对危险度4 级微生物,手套箱型实验室 Ⅲ级生物安全柜
个体防护,针对危险度4 级微生物,防护服型实验室 Ⅰ级、Ⅱ级生物安全柜
实验对象保护 Ⅱ级生物安全柜,柜内气流是层流的Ⅲ级生物安全柜
少量挥发性放射性核素∕化学品的防护 Ⅱ级B1 型生物安全柜,外排风式Ⅱ级A2型生物安全柜
挥发性放射性核素∕化学品的防护 Ⅰ级、Ⅱ级B2 型、Ⅲ级生物安全柜
 
  级生物安全柜
  图6 为Ⅰ级生物安全柜的原理图。房间空气从前面的开口处以0.38 m/s 的低速率进入安全柜,空气经过工作台表面,并经排风管排出安全柜。定向流动的空气可以将工作台面上可能形成的气溶胶迅速带离实验室工作人员而被送入排风管内。操作者的双臂可以从前面的开口伸到安全柜内的工作台面上,并可以通过玻璃窗观察工作台面的情况。安全柜的玻璃窗还能完全抬起来,以便清洁工作台面或进行其他处理。
  安全柜内的空气可以通过HEPA 过滤器按下列方式排出:
  (a)排到实验室中,然后再通过实验室排风系统排到建筑物外面;
  (b) 通过建筑物的排风系统排到建筑物外面;
  (c) 直接排到建筑物外面。HEPA 过滤器可以装在生物安全柜的压力排风系统(the exhaust plenum )里,也可以装在建筑物的排风系统里。有些Ⅰ级生物安全柜装有一体式排风扇,而其他的则是借助建筑物排风系统的排风扇。
  Ⅰ级生物安全柜是最早得到认可的,并且由于其设计简单,目前仍在世界各地广泛使用。Ⅰ 级生物安全柜能够为人员和环境提供保护,也可用于操作放射性核素和挥发性有毒化学品。但因未灭菌的房间空气通过生物安全柜正面的开口处直接吹到工作台面上,因此Ⅰ级生物安全柜对操作对象不能提供切实可行的保护。
  
  图6 Ⅰ级生物安全柜原理图
  A:前开口;B:窗口;C:排风HEPA 过滤器;D:压力排风系统 
  级生物安全柜
  在应用细胞和组织培养物来进行病毒繁殖或其他培养时,未经灭菌的房间空气通过工作台面是不符合要求的。Ⅱ级生物安全柜在设计上不但能提供个体防护,而且能保护工作台面的物品不受房间空气的污染。Ⅱ级生物安全柜有四种不同的类型(分别为A1、A2、B1 和B2 型),它们不同于Ⅰ级生物安全柜之处为,只让经HEPA 过滤的( 无菌的)空气流过工作台面。Ⅱ级生物安全柜可用于操作危险度2 级和3 级的感染性物质。在使用正压防护服的条件下,Ⅱ级生物安全柜也可用于操作危险度4 级的感染性物质。
  Ⅱ 级A1 型生物安全柜
  Ⅱ 级A1 型生物安全柜如图7 所示。内置风机将房间空气(供给空气) 经前面的开口引入安全柜内并进入前面的进风格栅。在正面开口处的空气流入速度至少应该达0.38 m/s。然后,供气先通过供风HEPA 过滤器,再向下流动通过工作台面。空气在向下流动到, , , 距工作台面大约6~18 cm 处分开, 其中的一半会通过前面的排风格栅,而另一半则通过后面的排风格栅排出。所有在工作台面形成的气溶胶立刻被这样向下的气流带走,并经两组排风格栅排出,从而为实验对象提供最好的保护。气流接着通过后面的压力通风系统到达位于安全柜顶部、介于供风和排风过滤器之间的空间。由于过滤器大小不同,大约70%的空气将经过供风HEPA 过滤器重新返回到生物安全柜内的操作区域,而剩余的30% 则经过排风过滤器进入房间内或被排到外面。
  Ⅱ 级A1 型生物安全柜排出的空气可以重新排入房间里,也可以通过连接到专用通风管道上的套管或通过建筑物的排风系统排到建筑物外面。
  安全柜所排出的经过加热和∕或冷却的空气重新排入房间内使用时,与直接排到外面环境相比具有降低能源消耗的优点。有些生物安全柜通过与排风系统的通风管道连接,还可以进行挥发性放射性核素以及挥发性有毒化学品的操作(表8)。
  
  图7 Ⅱ 级A1 型生物安全柜原理图
  A:前开口;B:窗口;C:排风HEPA 过滤器;D:后面的压力排风系统;E:供风HEPA 过滤器;F:风机 
  外排风式A2 型以及B1 型和B2 型生物安全柜
  外排风式Ⅱ级A2 型以及Ⅱ级B1型(图8)和Ⅱ级B2 型生物安全柜都是由Ⅱ级A1 型生物安全柜变化而来,这些不同类型的Ⅱ级生物安全柜,连同Ⅰ级和Ⅲ级生物安全柜的特点见表9。生物安全柜设计上的每一种变化可以使不同的类型适用于特定的目的(参见表8) 。这些生物安全柜相互间都有一定的差异,包括从前面的开口吸入空气的速度、在工作台面上再循环空气的量以及从安全柜中排出空气的量、安全柜的排风系统(是通过专门的排风系统还是通过建筑物的排风系统?是排到房间内还是排到建筑物的外面?)以及压力设置(安全柜是负压状态下的生物学污染管道和压力通风系统,还是由负压管道和压力通风系统所包围的生物学污染管道和压力通风系统?)。
  不同类型的Ⅱ级A 型和Ⅱ级B 型生物安全柜的详细介绍见参考文献7和8,也可参考生产商的说明手册。
  
  图8 Ⅱ 级B1 型生物安全柜原理图
  A:前开口;B:窗口;C:排风HEPA 过滤器;D:供风HEPA 过滤器;
  E:负压压力排风系统;F:风机;G:送风HEPA 过滤器。安全柜需要有与建筑物排风系统相连接的排风接口。    
  表9Ⅰ级、Ⅱ级以及Ⅲ 级生物安全柜之间的差异
生物安全柜 正面气流速度 气流百分数(%) 排风系统
 
 
m/s 重新循环部分 排出部分  
 
Ⅰ级a  
0.36
0 100 硬管
Ⅱ级A1型  
0.38~0.51
 
70
30 排到房间或套管连接处
外排风式Ⅱ级A2型a  
0.51
70 30 排到房间或套管连接处
Ⅱ级B1型a  
0.51
30 70 硬管
Ⅱ级B2型a  
0.51
0 100 硬管
Ⅲ级a  
NA
0 100 硬管
 
  NA,不适用。
  a所有生物学污染的管道均为负压状态,或由负压的管道和压力通风系统围绕。
  级生物安全柜
  Ⅲ级生物安全柜(图9)用于操作危险度4 级的微生物材料,可以提供最好的个体防护。Ⅲ级生物安全柜的所有接口都是“密封的”,其送风经HEPA 过滤,排风则经过两个HEPA 过滤器。Ⅲ级生物安全柜由一个外置的专门的排风系统来控制气流,使安全柜内部始终处于负压状态(大约124.5 Pa) 。只有通过连接在安全柜上的结实的橡胶手套,手才能伸到工作台面。Ⅲ级生物安全柜应该配备一个可以灭菌的、装有HEPA 过滤排风装置的传递箱。Ⅲ级生物安全柜可以与一个双开门的高压灭菌器相连接,并用它来清除进出安全柜的所有物品的污染。可以将几个手套箱连在一起以增大工作面积。Ⅲ级生物安全柜适用于三级和四级生物安全水平的实验室。
  
  图9 Ⅲ级生物安全柜(手套箱)示意图
  A:用于连接等臂长手套的舱孔;B:窗口;C:两个排风HEPA 过滤器;D:送风HEPA 过滤器;E:双开门高压灭菌器或传递箱;F:化学浸泡槽。安全柜需要有与独立的建筑物排风系统相连接的排风接口。
  生物安全柜的通风连接
  A1型和外排风式A2 型Ⅱ级生物安全柜的设计使用了“套管(thimble)”或“伞形罩(canopy hood)”连接。套管安装在安全柜的排风管上,将安全柜中需要排出的空气引入建筑物的排风管中。在套管和安全柜排风管之间保留一个直径差通常为2.5 cm 的小开口,以便让房间的空气也可以吸入到建筑物的排风系统中。建筑物排风系统的排风能力必须能满足房间排风和安全柜排风的要求。套管必须是可拆卸的,或者设计成可以对安全柜进行操作测试的类型。一般来讲,建筑物气流的波动对套管连接型生物安全柜的功能不会有太大的影响。
  Ⅱ级B1型和Ⅱ级B2型生物安全柜通过硬管,亦即没有任何开口地、牢固地连接到建筑物的排风系统,或者最好是连接到专门的排风系统。建筑物排风系统的排风量和静压必须与生产商所指定的要求正好一致。对硬管连接的生物安全柜进行认证时,要比将空气再循环送回房间或采用套管连接的生物安全柜更费时。
  生物安全柜的选择
  主要根据下列所需保护的类型来选择适当的生物安全柜:实验对象保护;操作危险度1~4 级微生物时的个体防护;暴露于放射性核素和挥发性有毒化学品时的个体防护;或上述各种防护的不同组合。表8 列出了每一种防护类型所推荐使用的生物安全柜。
  操作挥发性或有毒化学品时,不应该使用将空气重新循环排入房间的生物安全柜,即不与建筑物排风系统相连接的Ⅰ级生物安全柜,或�级A1 型及�级A2 型生物安全柜。Ⅱ级B1 型安全柜可用于操作少量挥发性化学品和放射性核素。Ⅱ级B2 型安全柜也称为全排放型安全柜,在需要操作大量放射性核素和挥发性化学品时,必须使用这一类型的安全柜。
  位置
  空气通过前面开口进入生物安全柜的速度大约为0.45 m/s。这样速度的定向气流是极易受到干扰的,包括人员走近生物安全柜所形成的气流、打开窗户、送风系统调整以及开关门等都可能造成影响。因此,最为理想的是,生物安全柜应位于远离人员活动、物品流动以及可能会扰乱气流的地方。在安全柜的后方以及每一个侧面要尽可能留有30 cm 的空间,以利于对安全柜的维护。在安全柜的上面应留有30~35 cm 的空间,以便准确测量空气通过排风过滤器的速度,并便于排风过滤器的更换。
  操作者
  生物安全柜如果使用不当,其防护作用就可能大大受到影响。操作者在移动双臂进出安全柜时,需要小心维持前面开口处气流的完整性,双臂应该垂直地缓慢进出前面的开口。手和双臂伸入到生物安全柜中等待大约一分钟,以使安全柜调整完毕并且让里面的空气“扫过”手和双臂的表面以后,才可以开始对物品进行处理。要在开始实验之前将所有必需的物品置于安全柜内,以尽可能减少双臂进出前面开口的次数。
  物品放置
  Ⅱ级生物安全柜前面的进气格栅不能被纸、仪器设备或其他物品阻挡。放入安全柜内的物品应采用70% 酒精来清除表面污染。可以在消毒剂浸湿的毛巾上进行实验,以吸收可能溅出的液滴。所有物品应尽可能地放在工作台后部*近工作台后缘的位置,并使其在操作中不会阻挡后部格栅。可产生气溶胶的设备(例如混匀器、离心机等)应*近安全柜的后部放置。像有生物危害性的废弃物袋、盛放废弃吸管的盘子以及吸滤瓶等体积较大的物品,应该放在安全柜内的某一侧。在工作台面上的实验操作应该按照从清洁区到污染区的方向进行。
  耐高压灭菌的生物危害性废弃物袋以及吸管盛放盘不应放在安全柜的外面,否则在使用这些物品时双臂就必须频繁进出安全柜,这样会干扰安全柜空气屏障的完整性,从而影响对人员和物品的防护。
  操作和维护
  大多数生物安全柜的设计允许整天24 h 工作。研究人员还发现,连续工作有助于控制实验室中灰尘和颗粒的水平。向房间中排风或通过套管接口与专门的排风管相连接的�级A1 型及�级A2 型生物安全柜,在不使用时是可以关闭的。其他如�级B1 型和�级B2 型生物安全柜,是通过硬管安装的,就必须始终保持空气流动以维持房间空气的平衡。在开始工作以前以及完成工作以后,应至少让安全柜工作5min 来完成“ 净化” 的过程, 亦即应留出将污染的空气排出安全柜的时间。
  生物安全柜的所有维修工作应该由有资质的专业人员来进行。在生物安全柜操作中出现的任何故障都应该报告,并应在再次使用之前进行维修。
  紫外灯
  生物安全柜中不需要紫外灯。如果使用紫外灯的话,应该每周进行清洁,以除去可能影响其杀菌效果的灰尘和污垢。在安全柜重新认证时,要检查紫外线的强度,以确保有适当的光发射量。房间中有人时一定要关闭紫外灯,以保护眼睛和皮肤,避免因不慎暴露而造成伤害。
  明火
  在生物安全柜内所形成的几乎没有微生物的环境中,应避免使用明火。使用明火会对气流产生影响,并且在处理挥发性物品和易燃物品时,也易造成危险。在对接种环进行灭菌时,可以使用微型燃烧器或电炉,而不应使用明火。
  溢出
  实验室中要张贴如何处理溢出物的实验室操作规则,每一位使用实验室的成员都要阅读并理解这些规程。一旦在生物安全柜中发生有生物学危害的物品溢出时,应在安全柜处于工作状态下立即进行清理。要使用有效的消毒剂,并在处理过程中尽可能减少气溶胶的生成。所有接触溢出物品的材料都要进行消毒和/或高压灭菌。
  认证
  在安装时以及每隔一定时间以后,应由有资质的专业人员按照生产商的说明对每一台生物安全柜的运行性能以及完整性进行认证,以检查其是否符合国家及国际的性能标准。安全柜防护效果的评估应该包括对安全柜的完整性、HEPA 过滤器的泄漏、向下气流的速度、正面气流的速度、负压/ 换气次数、气流的烟雾模式以及警报和互锁系统进行测试。还可以选择进行漏电、光照度、紫外线强度、噪声水平以及振动性的测试。在进行这些测试时,检测人员要经过专门的培训,采用专门的技术和仪器设备。强烈建议由有资质的专业人员来进行测试。
  清洁和消毒
  由于剩余的培养基可能会使微生物生长繁殖,因此在实验结束时,包括仪器设备在内的生物安全柜里的所有物品都应清除表面污染,并移出安全柜。
  在每次使用前后,要清除生物安全柜内表面的污染。工作台面和内壁要用消毒剂进行擦拭,所用的消毒剂要能够杀死安全柜里可能发现的任何微生物。在每天实验结束时,应擦拭生物安全柜的工作台面、四周以及玻璃的内外侧等部位来清除表面的污染。在对目标生物体有效时,可以采用漂白剂溶液或70% 酒精来消毒。在使用如漂白剂等腐蚀性消毒剂后,还必须用无菌水再次进行擦拭。
  推荐将安全柜一直维持运行状态。如果要关闭的话,则应在关机前运行5min 以净化内部的气体。
  清除污染
  生物安全柜在移动以及更换过滤器之前,必须清除污染。最常用的方法是采用甲醛蒸气熏蒸。应该由有资质的专业人员来清除生物安全柜的污染。
  个体防护装备
  在使用生物安全柜时应穿着个体防护服。在进行一级和二级生物安全水平的操作时,可穿着普通实验服。前面加固处理的反背式实验隔离衣具有更好的防护效果,应在进行三级和四级生物安全水平(防护服型实验室除外)的操作时使用。手套应套在隔离衣的外面,可以戴加有松紧带的套袖来保护研究人员的手腕。有些操作可能还需要戴口罩和安全眼镜。
  警报器
  可以在两种警报器中选择一种来装备生物安全柜。窗式警报器只能装在带有滑动窗的安全柜上。发出警报时表明操作者将滑动窗移到了不当的位置。处理这种警报时,只要将滑动窗移到适宜的位置就可以了。气流警报器报警时,表明安全柜的正常气流模式受到了干扰,操作者或物品当即处于危险状态。当气流警报响起时,应立刻停止工作,并通知实验室主管。生产商的说明手册中将提供更详细的资料,在生物安全柜的使用培训中也应包括这一方面的内容。
  补充资料
  选择正确类型的生物安全柜,进行安装并正确使用,同时每年进行认证,这是一个复杂的程序。强烈推荐在经过良好培训并具有丰富生物安全操作经验的专家监督下来进行上述工作。该专家应非常熟悉“参考文献”部分中所列出的相关文献,并且经过了有关生物安全柜各方面的培训。操作者应接受生物安全柜操作和使用的正规培训。
 

 

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